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绝经后骨质疏松（PMOP）是一种由于女性绝经后雌激素水平降低，导致破骨细胞（OC）和成骨细胞（OB）骨重塑失衡，引起人体骨量降低、易发生脆性骨折的全身性代谢性疾病。

本研究采用体外和体内实验评估骨疏康通过影响OC来源外泌体抑制OC分化，促进OB分化，实现双向调节作用。

构建OC模型采用M-CSF（20ng/mL）、RANKL（50ng/mL）处理RAW264.7细胞进行诱导；构建OB模型采用成骨诱导液处理的BM-MSC进行诱导。有效药物血清确认结果（图1）相对于5%、10%、15%Drug抑制破骨分化效果更为显著，且两者之间差异无统计学意义，因此后续实验采用10%Drug进行细胞干预。

设立对照组和药物组，采用适合药物血清浓度干预破骨分化模型。处理7天后，去除上清液，更换新鲜培养基，24h后收集对照组外泌体（Exo-Con）和药物组外泌体（Exo-Drug）。Con和10%Drug处理后的破骨分化诱导RAW264.7细胞外泌体（Exo-Con和Exo-Drug）均特异性表达CD9、CD63、CD81蛋白，表明外泌体提取和分离效果较好，蛋白质大小分别为25、35、23kD（图2）。

Con和Drug各自处理后的破骨分化诱导RAW264.7细胞外泌体（Exo-Con和Exo-Drug）形态均呈现不规则圆形，大小在60~100nm范围（图3）。

10%Drug和Con处理RAW264.7源破骨细胞的外泌体（Exo-Con和Exo-Drug）经过Dil标记后，和BM-MSC源成骨细胞共培养，发现两种血清处理破骨细胞的外泌体均能被成骨细胞摄取，且摄取效率相近（图4）。

各组成骨细胞ALP活性检测显示（图5），与空白组比较，对照组ALP活性增加（P<0.01）。与对照组比较，对照外泌体组及药物外泌体组ALP活性降低，且对照外泌体组ALP活性较药物外泌体组更低（P<0.01）。

各组成骨相关基因检测结果比较显示（图6），与空白组比较，对照组OCN、OPN、RUNX2mRNA表达升高（P<0.01）；与对照组比较，对照外泌体组及药物外泌体组OCN、OPN、RUNX2mRNA表达降低，且对照外泌体组较药物外泌体组降低更多（P<0.01）。

将18只12周龄雌性SD大鼠随机分配至3组中，每组6只，设为假手术组、模型组、药物实验组；模型组和药物实验组构建卵巢切除（ovariectomy，OVX）模型作为本研究的PMOP模型。因此OVX+Drug组大鼠采用1.8g/kg骨疏康灌胃处理，早晚分2次灌胃，每次剂量0.9g/kg，每次灌胃体积5mL/kg；OVX组采用生理盐水灌胃处理，早晚分两次灌胃，每次灌胃体积5mL/kg；假手术组大鼠麻醉开口后，不取出卵巢，缝合后消毒。建模8周后，处死大鼠进行取材，统一取左侧股骨。经甲醛固定后进行脱钙切片。

HE染色结果比较（图7）显示：模型组骨质疏松大鼠关节部位的软骨层损伤严重，骨小梁中有较多的破骨陷窝，骨干的骨密质部位出现较多破损和破骨陷窝；骨疏康治疗后软骨层破损状态减轻，骨小梁中破骨陷窝减少，骨干的骨密质部位破损现象减轻。

TRAP染色结果显示（图8）与假手术组比较，模型组大鼠TRAP阳性率增加（P<0.01），药物实验组TRAP阳性率较模型组降低（P<0.01）。

各组大鼠骨相关蛋白检测结果显示（图9）与假手术组比较，模型组OCN、OPN、RUNX2蛋白表达降低，RANKL、OPG蛋白表达增加（P<0.01）；与模型组比较，药物实验组OCN、OPN、RUNX2蛋白表达增加，RANKL、OPG蛋白表达降低（P<0.01）。

研究结论

外泌体是一种细胞分泌的囊泡，内含组织或者细胞特异性蛋白、脂质和核酸片段，具有一定的细胞间信使作用，能通过水平转移或细胞-受体相互作用来进行内容物的传递，调节其他细胞的功能。BMSCs来源外泌体可抑制细胞凋亡信号通路，促进OB增殖，改善POP。OC来源外泌体具有促进OC分化，调控破骨和成骨交流，调节骨代谢的作用。OB来源外泌体也具有抗OP的作用，以及肌细胞、血管内皮细胞来源的外泌体均具有抗OP的治疗潜力。骨疏康含药血清可以抑制OC分化，有效改善OC外泌体对OB分化的抑制作用。另外，骨疏康能有效促进PMOP模鼠OB分化，同时减少OC分化。